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            新聞 Company News

            小分子藥物靶點發現與鑒定技術進展

            發布時間:2023-06-18 07:47:59 | 來源:【藥物研發團隊 2023-6-18】
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            藥物大多通過與人體內“靶點”分子相互作用而產生療效。新的藥物作用靶點是一系列新藥發現的突破口,尋找藥物作用的新靶點已成為當今創新藥研發激烈競爭的焦點。從藥物開發角度來看,藥物的效果很大程度上取決于它的作用靶點。一些難以征服的疾病至今仍然沒有理想的治療藥物就是因為到目前為止還沒有找到合適的藥物作用靶點。

            藥物靶點是指藥物與機體內生物大分子的直接結合部位,主要包括受體、酶、離子通道、轉運體、核酸等生物大分子,藥物分子通過作用于藥物靶點并調控藥物靶點的生物學功能進而發揮其作用。此外,有些藥物通過其理化作用或補充機體所缺乏的物質而發揮作用?,F有藥物中,超過50%的藥物以受體為作用靶點,受體成為最主要和最重要的作用靶點;超過20%的藥物以酶為作用靶點,特別是酶抑制劑,在臨床應用中具有特殊地位;6%左右的藥物以離子通道為作用靶點;3%的藥物以核酸為作用靶點;20%藥物的作用靶點尚有待進一步研究。

            現代新藥研發的關鍵是首先要尋找、確定藥物作用靶點。發現并鑒定新穎的藥物作用靶點是新藥開發的首要任務。迄今已發現并鑒定的藥物作用靶點約500個,其中受體尤其是G-蛋白偶聯的受體(GPCR)靶點占絕大多數,另外還有酶、抗菌、抗病毒、抗寄生蟲藥的作用靶點。合理藥物設計可以依據生命科學研究中所揭示的包括酶、受體、離子通道、核酸等潛在的藥物作用靶點,或其內源性配體以及天然底物的化學結構特征來設計藥物分子,以發現選擇性作用于靶點的新藥?,F代小分子化學新藥大部分是基于已知靶點進行設計,靶點較為明確。因此,鑒定小分子藥物的作用靶點對于新藥設計、理解小分子藥物的作用機制和應用有著至關重要的作用,同時也可以進一步發現小分子藥物的脫靶靶標、脫靶效應、副作用以及靶點生物大分子參與的生物學功能。

            藥物作用靶點的鑒定不僅可以建立藥物活性與細胞表型或位點生物學功能之間的聯系,闡明藥物的作用機理,還可以發現藥物的脫靶效應和耐藥機制,發現治療藥物的新靶點,并在藥物發現的早期階段預測潛在的副作用和毒性,從而降低藥物研發失敗的風險。常規的藥物靶點鑒定一般采用基于化學修飾的方法和基于表型分析的方法?;瘜W修飾方法包括親和層析、活性位點定向探針技術和蛋白質微陣列技術等。但基于化學修飾的方法存在一定的局限性,其均需對小分子藥物或蛋白質庫進行標記或衍生,而小分子藥物可能缺乏用于共價交聯的位點,或者化學修飾會影響藥物與靶蛋白的結合。另外,通過細胞表型篩選的藥物發現策略更容易得到原創新藥,而且有利于開發眾多發病機制尚不明確的疾病治療藥物。但是,基于細胞表型的篩選無法提供活性化合物作用的靶標信息,需要回溯鑒定那些因與小分子藥物直接發生作用而引起功能改變的蛋白質。藥物作用靶點的發現和鑒定充滿挑戰,目前還沒有一個完美的方法可以快速準確找到靶標,但科學家已經開發了眾多行之有效的藥物靶點發現和鑒定方法。除了標記類小分子藥物作用靶點發現和鑒定技術外,非標記、非化學修飾小分子藥物作用靶點發現和鑒定技術也已在新藥研發中得到應用。

            一、藥物靶點

            酶是由機體細胞產生的具有催化活性和高度專一性的特殊蛋白質。由于酶參與一些疾病的發病過程,在酶催化下產生一些病理反應介質或調控因子,因此酶成為一類重要的藥物作用靶點。藥物以酶為作用靶點,對酶產生抑制、誘導、激活或復活作用。此類藥物多為酶抑制劑,全球銷量排名前20位的藥物,有50%是酶抑制劑。例如奧美拉唑通過抑制胃黏膜的H﹢-K﹢ATP酶,抑制胃酸分泌;喹諾酮類抑制DNA回旋酶,影響DNA合成而發揮殺菌作用;卡托普利抑制血管緊張素Ⅰ轉換酶;西咪替丁抑制肝藥酶。苯巴比妥誘導肝藥酶;解磷定使被有機磷酸酯類所抑制的膽堿酯酶復活等。有些藥物本身就是酶,例如胃蛋白酶、胰蛋白酶。也有一些藥物是酶的底物,需經轉化后發揮作用。例如左旋多巴通過血腦屏障后,在紋狀體中被多巴脫羧酶所代謝,代謝產物多巴胺發揮補充中樞遞質的作用?;前奉愅ㄟ^與對氨苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶,妨礙二氫葉酸的合成,抑制細菌體內葉酸的代謝而干擾核酸的合成。

            基因

            現代遺傳學家認為,基因是DNA分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列的總稱,是具有遺傳效應的DNA片段。近年來,隨著基因研究的不斷深入,人類基因組計劃的實施,某些疾病的相關基因陸續被找到?;蛑委熓侵竿ㄟ^基因轉移方式將正?;蚧蚱渌泄δ艿幕驅塍w內,并使之表達以獲得療效。1990年人類歷史上首次成功地進行了腺苷脫氨酶缺陷患兒人體基因治療試驗,掀起了人類醫學史上的一次革命。迄今,全世界已經批準了近600個基因治療臨床試驗。如囊性纖維化是常染色體隱性遺傳病,其基因定位在7q22.3—q23.1?;颊呤軗p細胞的氯離子轉運異常,以肺部受累為多見。臨床試驗方案一般采用腺病毒和陽離子脂質體為載體,將編碼CF跨膜導電調節因子基因導入患者呼吸道上皮細胞,治療后基因轉移部位的氯離子轉運缺陷可獲得糾正。與基因治療不同,基因工程藥物是指應用基因工程技術生產的藥品,這類藥物是將目的基因與載體分子組成重組DNA分子后轉移到新的宿主細胞系統,并使目的基因在新的宿主細胞系統內進行表達,然后對基因表達產物進行分離、純化和鑒定,大規模生產目的基因的表達產物。已應用的產品有人胰島素、人生長素、干擾素類、組織纖溶酶原激活劑、重組鏈激酶、白介素類、促紅細胞生成素等。核酸藥物是指在核酸水平上發揮作用的藥物。干擾或阻斷細菌、病毒和腫瘤細胞的核酸合成,就能有效的殺滅或抑制細菌、病毒和腫瘤細胞。以核酸為作用靶點的藥物主要包括一些抗生素,如利福平、利福定和利福噴丁等利福霉素類抗生素,作用機制是影響RNA的合成;抗病毒藥阿昔洛韋、阿糖腺苷等,作用機制是干擾DNA的合成;喹諾酮類抗菌藥如環丙沙星、氧氟沙星等,作用機制是阻斷DNA合成;抗腫瘤藥物如環磷酰胺、甲氨蝶呤、絲裂霉素等,作用機制是破壞DNA的結構和功能等。

            (三)離子通道

            離子通道由肽鏈經多次往返跨膜形成的亞基組成。主要的離子通道有鈣離子、鉀離子、鈉離子及氯離子通道,能調節細胞膜內外無機離子的分布,這些離子通道目前均已被克隆。通道的開放或關閉影響細胞內外無機離子的轉運,能迅速改變細胞功能,引起神經興奮、心血管收縮或腺體分泌。有些藥物通過激活受體調控離子通道,例如激活N膽堿受體可引起鈉離子通道開放,激活GABA受體可引起氯離子通道開放,激活α腎上腺素受體可引起鈣離子通道開放等。有些離子通道就是藥物的直接作用靶點,藥物通過改變離子通道的構象使通道開放或關閉。例如阿米洛利阻斷腎小管鈉離子通道,左氨氯地平阻斷鈣離子通道,吡那地爾激活血管平滑肌鉀離子通道等。

            (四)免疫系統

            正常免疫應答反應在抗感染、抗腫瘤及抗器官移植排斥方面具有重要意義。影響免疫功能的藥物是通過影響免疫反應的一個或多個環節而發揮免疫抑制或免疫增強作用。某些藥物本身就是免疫系統中的抗體(如丙種球蛋白)或抗原(疫苗)。免疫抑制藥如環孢素,可用于器官移植和治療其他藥物無效的難治性自身免疫性疾病。免疫增強藥多作為輔助治療藥物,用于免疫缺陷疾病,如艾滋病、慢性感染及惡性腫瘤等。

            (五)轉運體

            轉運體是存在于細胞膜上的蛋白質成分,能促進內源性遞質或代謝產物的轉運過程。轉運體是細胞內外物質轉運的分子基礎,包括離子轉運體、神經遞質轉運體、營養物質轉運體以及外來物質轉運體。有些藥物可通過對某種轉運體的抑制作用而產生效應,例如丙磺舒競爭性抑制腎小管對弱酸性代謝物的主動轉運,抑制原尿中尿酸再吸收,用于痛風的防治。再如利尿藥呋塞米及氫氯噻嗪抑制腎小管對鈉離子、鉀離子及氯離子再吸收而發揮利尿作用,可卡因及三環抗抑郁藥抑制交感神經末梢對去甲腎上腺素攝取引起的擬交感作用,都是通過作用于轉運體產生效應。藥物轉運是機體對藥物處置的重要環節。藥物轉運體本質上屬于外來物質轉運體,是機體內物質轉運系統的組成部分。藥物轉運體在藥物吸收、分布、代謝、排泄等體內過程中起非常重要的作用,是影響藥物效應以及產生藥物相互作用的重要因素。根據藥物的轉運方式,藥物轉運體分為外排和攝取性兩種。前者包括以多藥耐藥基因為代表的ABC轉運體;后者主要包括以有機陰離子轉運多肽1B1為代表的有機陰離子轉運蛋白。近年來,對藥物轉運體的了解逐步深入,成為藥理學研究中不可忽視的一個組成部分。

            二、理想的藥物靶點特征

            一個理想的藥物靶點應該是安全、有效且符合臨床和商業的要求,并且具有“可成藥性”。理想的藥物靶點一般具備以下特征:

            1、可以單獨存在或形成聚合體。

            2、具有可以與其他結構物質相結合的部位或位點。

            3、其結構可以發生變化,發揮生理、病理調節作用,并在復雜的調節過程中起主要作用。

            4、存在內源性與之結合的小分子或外源性配基,該配基具有藥理活性。

            三、用于藥物作用靶點發現和鑒定研究的生物樣本

            作為藥物研發極為關鍵的一環,發現并鑒定潛在治療靶點的功能及其在疾病中的作用是靶點發現和特征鑒定的開始。用于藥物作用靶點發現和鑒定研究的生物樣本一般為基因、蛋白質、細胞,其流程一般是先利用基因水平、蛋白水平、細胞水平等技術獲取疾病相關的生物分子信息,并進行生物信息學分析;再對相關的生物分子進行功能研究和特征鑒定,從而確定藥物靶標。

            從具體方法說,目前已有各種不同的技術手段從基因水平、蛋白質水平、細胞水平來尋找藥物作用靶點,這些包括分子探針技術、表型分析技術、基因組學技術、蛋白質組學技術、轉基因生物技術、成像技術、生物標志物技術等。

            (一)從基因水平來尋找藥物作用靶點

            下一代測序(NGS)技術能對人類群體的基因型-表型關系進行高通量分析,以遺傳學為依據進行藥物開發,能同時對百萬條,甚至更多的DNA進行測序,并可實現在相對較低成本下對多基因、全外顯子,甚至全基因組進行多種變異類型檢測,且所需樣本量和檢測周期不會增加。

            NGS在靶點發現中的應用主要有兩種方式:一種是對目標人群的基因測序可以同時揭示多種疾病或特征的表型特異性藥物靶標;另一種是NGS可以鑒定定量表型極端值與罕見變異的關聯來識別特定表型的基因靶點。

            (二)從蛋白質水平來尋找藥物作用靶點

            人體中所含蛋白質的種類遠遠超過人類基因的數目,一個基因由于有不同的剪切方式可以同時編碼幾種或更多種蛋白質,而且目前已知的藥物靶點中,絕大多數為蛋白質。因此,從蛋白質層面尋找藥物作用靶點,是藥物研發的重要方向。

            從蛋白質水平發現和鑒定藥物作用靶點通常采用的策略是比較疾病狀態和正常生理狀態下蛋白質的異常表達,從而尋找藥物作用的靶標。質譜技術已經成為應用于蛋白質組學研究中的強有力工具及核心技術。

            (三)從細胞水平來尋找藥物作用靶點

            基于細胞的高內涵藥物作用靶點發現是通過使用高通量活細胞成像技術來篩選復雜細胞系統中的化合物,能實現在單細胞水平上對化合物多靶點、多參數的同步檢測,可以獲得豐富的生物學信息,包括單個細胞圖像和各項指標、細胞群體的統計分析結果、細胞數量和形態的改變、亞細胞結構的變化、熒光信號隨時間的變化、熒光信號空間分布的改變等各方面的信息。

            高內涵篩選可以從疾病相關基因調控通路和網絡水平上研究藥物的作用機制、代謝途徑和潛在毒性等;同時,可以幫助深入了解化合物或亞細胞群復雜的相互作用,使在細胞水平全面評價化合物的成藥性成為可能。

            高內涵篩選克服了常規成像操作復雜、檢測速度慢、檢測時間長、數據分析復雜的缺點。通過有效結合高速多通道共聚焦成像檢測技術及強大的數據分析功能,高內涵細胞成像分析技術能夠快速、批量、自動地捕獲細胞、亞細胞或組織圖像,并對細胞表型進行量化處理,批量實現從圖片信息到數字信息的轉換,以及高通量圖像信息的自動提取和分析。

            四、藥物作用靶點發現和鑒定技術

            小分子藥物作用靶點的發現和鑒定流程一般是首先獲取與疾病相關的生物分子信息,然后研究這些分子的功能以確定藥物作用靶點,最后針對靶點設計化合物進行有效性驗證。目前,化學小分子作用靶點的發現和鑒定方法多種多樣,各具優劣,既有獨立性,又有互補性,其結合運用能更有利于化學小分子藥物作用靶點的發現和鑒定。以下簡要介紹常用的化學小分子藥物作用靶點發現和鑒定技術。

            (一)以基因組學為基礎的藥物作用靶點發現和鑒定方法

            以基因組學為基礎的藥物作用靶點發現和鑒定方法主要分析化學小分子對基因組表達的影響,獲得小分子作用的特征表達譜,通過分析確定分子靶點。但由于基因表達與蛋白質表達之間的對應關系存在一定的不確定性,不能直接確定藥物作用的靶點,因此存在一定的局限性。

            1、基因芯片技術

            基因芯片技術在DNA測序、基因表達分子與基因調控機制研、基因藥物設計與篩選等方面廣泛應用。

            2、特征基因及人工構建菌株

            基因表達譜存在較多無效信息和干擾信息,通過一定的選取可發掘在相應組織(如腫瘤組織)中特異性表達的基因和藥物治療的靶序列。特征基因集合建立后,聯合人工構建菌株技術,用這些基因構建相關預測菌株,這些預測菌株的基因表達可直接揭示相關藥物的作用機制。近年來,基因組測序技術的發展促進了高通量研究,由于對酵母菌的生理學特點較為清楚,且酵母菌具有繁殖周期較短等特點,使酵母菌迅速成為尋找新藥和研究藥物作用機制的重要工具。隨著分子條形碼技術的發展,從以微陣列為基礎的分析到下一代測序,使得單倍劑量不足分析和純和性缺失分析的數據分析更加靈活、動態范圍更大、檢測范圍更廣。

            3、生化抑制策略

            在基因組中,由一個基因突變引起的表型改變可被其他基因的過表達消除,該現象是化學抑制策略的基礎。生化抑制策略是用化學抑制劑作為“突變基因”,而其他部分純化的蛋白混合物作為一種“過表達蛋白”,以此研究相關化學抑制劑的作用方式與靶點。生化抑制策略雖然可用于確定抑制性靶點以及信號通路中的其他化合物,但也有局限性,僅可應用于可融合、可片段化的蛋白質,該方法并不適用于對疏水性蛋白質的研究。

            (二)以蛋白質組學為基礎的藥物作用靶點發現和鑒定方法

            以蛋白質組學為基礎的藥物作用靶點發現和鑒定方法主要是尋找小分子作用的靶蛋白質,將其分離純化,由此確定小分子藥物作用的靶點,為其作用方式提供直接證據。

            1、蛋白質差異表達的應用

            化學小分子作用前后細胞蛋白質的種類和數量發生了變化,通過對差異表達的檢測可以估計小分子化合物的作用方式,篩選出相應的靶點。

            (1)熒光差異二維凝膠電泳技術

            相對于普通凝膠電泳,熒光差異二維凝膠電泳技術可在一塊丙烯凝膠上直接比較兩種蛋白質樣本,避免了兩塊凝膠比較時可能產生的系統誤差。此外,可以定量分析大量修飾過的蛋白,提供結構和翻譯后的修飾信息,使重要生物系統變化的鑒定和蛋白質功能的闡述得以實現;同時可以定量分析截短的或部分降解的蛋白質。但由于疏水蛋白、膜蛋白以及等電點或極端大或小分子量的蛋白質難以保持溶解狀態,因而難以用此法鑒定。此外,熒光差異二維凝膠電泳技術難以區分具有相似分子量和等電點的蛋白質。

            (2)色譜共洗脫

            配體-靶點復合物在高效液相色譜共洗脫加上配體-靶蛋白結合導致化合物色譜滯留時間的特征性轉移,從而可用高效液相色譜法-質譜/質譜法來確定靶蛋白。運用該法雖然可以免去對化合物或蛋白質進行固定或標記,但由于需要分離未結合和結合的化合物,導致共價結合物被排除在外。此外,該方法需要溶解較多的靶蛋白,使藥物和靶蛋白的反應受到限制。

            2、蛋白質親和特性的應用

            蛋白質親和特性的應用是利用分子間的特異性結合進行蛋白質的分離和純化。目前的親和純化技術主要有親和層析技術、串聯親和純化法、細胞培養穩定同位素標記法、小分子探針以及蛋白質芯片技術等。

            利用蛋白質親和特性研究藥物與靶蛋白的結合,需要對藥物分子進行構效關系研究,但無需了解藥物與靶蛋白之間可能發生的某些特定的細胞或生化反應,研究可能受藥物小分子衍生物的限制,合適的可作為陰性對照的化學小分子藥物也較難得到。

            (1)細胞培養穩定同位素標記法

            細胞培養穩定同位素標記法是在細胞培養過程中利用穩定同位素標記的氨基酸結合質譜技術對蛋白質的表達進行定量分析的一種體內代謝標記技術。量分析的一種體內代謝標記技術。目前標記的氨基酸的種類已擴展到亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸以及酪氨酸等。作為體內代謝謝標記技術,其標記效率高,不需要對樣品進行預處理,具有高通量性,且樣本需求量少、操作簡單、定量精確,適用于大分子量、復雜生物樣品的分析,可以鑒定出更多低豐度蛋白,包括細胞表面蛋白、細胞器特異性蛋白、磷酸化蛋白或糖蛋白等經翻譯后修飾的蛋白。但該方法也具有一定的局限性:

            ①實驗中需要將單個蛋白分離純化,導致誤差較大;

            ②不相關的共洗脫的離子發生同位素聚集,使定量分析復雜化;

            ③為了保證同位素標記的氨基酸混合的完整性,限制使用處于高水平復制的細胞;

            ④不能使用人體或其他組織樣本。

            (2)小分子探針

            小分子探針主要由報告基團、連接基團以及活性基團組成,作用原理是小分子活性基團部分與靶標緊密結合,而報告基團部分可有效標記靶標生物大分子,之后可通過親和層析、凝膠電泳和質譜分析等手段確認靶標蛋白。傳統探針要求探針分子與靶蛋白不可逆結合,但由于報告基團體積較大,有可能阻礙細胞對探針的吸收,影響探針的分布及其親和力,故出現了不帶報告基團的bio-orthogonal探針,先用不帶報告基團的探針與靶標蛋白共價結合,再通過bio-orthogonal反應將被標記的蛋白與報告蛋白連接,避免因報告基團(生物素、熒光基團等)體積過大而影響探針分子在細胞內的分布以及對靶標的親和力,方便在活細胞內的研究。但小分子探針確定靶標也具有一定的局限性:

            ①細胞內豐度低或與探針結合力弱的蛋白難以鑒定;

            ②探針與雜蛋白非特異性結合具有一定的干擾作用,采用高強度洗脫和陰性對照可消除一定的影響;

            ③需要對化合物進行構效分析,且合成的探針分子應保持原有的生物活性和作用機制,所以工作量大且需要豐富的醫藥化學專業知識:

            ④為了將化合物與連接鏈和報告基團連接,通常還需要在化合物母核上引入氨基、羥基、羧基等官能團,這些基團的引入可能對化合物的活性產生影響。

            (3)蛋白質芯片技術

            蛋白質芯片技術是將一個蛋白質庫以二維可設定位置的網格格式固定在一個載玻片或芯片上,可測定親和力低和含量低的蛋白質。由于蛋白質會變性,因此在蛋白質芯片的制造過程中要保證蛋白質的構象和功能,并且要表達和純化大量正確折疊且有活性的蛋白質,蛋白質芯片耗時長,實驗要求高,制造難度遠遠高于基因芯片。

            根據實驗樣品的添加順序,蛋白質芯片技術可分為正相芯片技術和反相芯片技術。正相芯片技術具有高特異性,但十分耗時,且需要大量的蛋白質探針;反相芯片減少了檢測蛋白質抗原所需的抗體探針的量,但對于相對低濃度樣本中靶蛋白的敏感性降低。

            近年來一些新的蛋白質微陣列技術如巨磁阻檢測芯片技術(靈敏度高,巨大磁抗性傳感器定量分析并用磁納米微粒標記),蛋白直接由微陣列上的核酸進行表達的核酸可控蛋白芯片技術(龐大的蛋白質庫)等也逐步被應用。

            3、蛋白質穩定性的應用

            基于靶蛋白與小分子結合后穩定性變化,包括抗酶解活性、熱穩定性等,發展出了一系列小分子靶標的篩選鑒定方法。

            (1)蛋白質抗酶解活性

            小分子化合物與蛋白質的結合可能會掩蓋蛋白酶的剪切位點或結合小分子后的靶蛋白局部或整體構象的穩定性增加,對蛋白酶的易感性下降,導致結合小分子的靶蛋白可能較未結合狀態的靶蛋白不易被蛋白酶降解?;谶@個原理,發展出藥物親和反應靶標穩定性(DARTS)研究方法。細胞裂解液與小分子化合物混合,裂解液中蛋白質被嗜熱菌蛋白酶和鏈霉蛋白酶裂解,通過免疫印跡法分離出因為與小分子結合而未被裂解的蛋白質,最后進行質譜分析,確定靶蛋白。

            相對于親和色譜分析法,DARTS技術中小分子化合物不需要經過構效分析或對配體進行化學修飾??梢月摵鲜褂肈ARTS與多向蛋白質鑒定技術,進一步增加檢出靶蛋白的靈敏度。

            (2)氧化速率的蛋白穩定性

            氧化速率的蛋白穩定性(SPROX)技術與DARTS類似,DARTS利用的是蛋白質不同的水解特性,而SPROX利用的是不同的折疊狀態和熱力學穩定性。小分子化合物與靶蛋白結合后可能對靶蛋白的折疊狀態以及熱動力學穩定性產生影響而使靶蛋白發生變化。一定時間和一定濃度的化學變性劑存在時,蛋白質的甲硫氨酸殘基只發生部分氧化,不同折疊狀態的蛋白質氧化程度不同,即可以通過氧化速率反映蛋白質的不同折疊狀態。

            SPROX也具有一定的局限性:

            ①只能準確檢測樣本中含量較高的蛋白質靶標;

            ②只有含有甲硫氨酸的蛋白質才適用這個方法,即使含有甲硫氨酸,也并非所有的甲硫氨酸殘基都會展現出不同的氧化速率足夠用來確定熱動力學穩定性的改變。

            (3)蛋白質熱穩定性

            Martinez Molina等將臨床藥物作用于細胞裂解液中4個不同的靶蛋白時發現,所有的靶蛋白都有其獨特的熔解曲線,當已知可結合到這些蛋白上的藥物加入細胞裂解液中,可以觀測到明顯的熔解曲線移動,根據這一原理開發出細胞熱轉移(CETSA)方法,其可以直接測量藥物到達靶細胞的程度,檢測小分子在細胞裂解液甚至完整細胞組織中的作用。

            CETSA適用范圍廣,可在細胞水平和動物水平直接測量藥物分子是否到達作用靶點,驗證了重要的臨床藥物靶標。根據藥物在體內和體外與靶標結合時間、結合程度的差異,可進一步研究小分子藥物在體內轉運激活的過程。Savitski等通過對人K562細胞進行熱力學蛋白質組分析,觀察到完整細胞和細胞裂解液的熔解特性存在差異,用抑制劑十字孢堿和CSK3182571驗證了蛋白質組分析的可行性。同時確定了亞鐵血紅蛋白生物合成酶亞鐵鰲合酶是多種激酶抑制劑的脫靶蛋白,進一步解釋了原卟啉癥患者畏光的可能原因。此外,采用此方法研究發現,藥物達沙替尼導致了慢性髓系白血病BCR-ABL信號通路下游蛋白的熱轉移。

            CETSA也有局限性。CETSA的蛋白熔解曲線是基于靶蛋白與小分子結合后熱穩定性增強這一特性建立起來的,而大的蛋白質包括蛋白質復合物有可能沒有這種小分子引起的反應或者反應微弱。此外,加熱可能會導致小分子與血漿蛋白結合和細胞通透性改變等,所以應盡可能地縮短加熱時間,減少樣本量或徹底改變樣本幾何學特性以及加熱裝置以改善熱傳遞。另外,若小分子參與細胞快速反應信號通路,則有可能影響蛋白的翻譯后修飾,所以細胞與小分子化合物的預先孵育時間會影響抗體對靶蛋白的檢測能力。一些蛋白質的配體結合位點的結構域未折疊,也無法通過CETSA進行靶標鑒定。

            (4)熱蛋白質組分析技術

            熱蛋白質組分析(TPP)技術是將CETSA技術與多重定量質譜法相結合而發展起來的藥物作用靶點發現和鑒定技術,大大提高了蛋白質檢測的通量和分析速度,因此TTP技術又被稱為MS-CETSA技術。TPP技術通過在單次LC-MS/MS實驗中同時監測10個不同溫度下全蛋白質組的熱穩定性變化,可獲得大量可溶性蛋白的熱熔曲線、不僅可用于藥物靶點的發現,還可以用于檢測藥物的脫靶效應,以及藥物﹣靶蛋白的相互作用模式研究。與CETSA技術一樣,TPP技術可以用于完整活細胞及細胞裂解液水平的研究,通過將這兩個水平的樣品所得結果進行綜合分析,可區分藥物的直接作用靶點及通過影響上下游信號通路而發揮作用的間接靶點。除此之外,TPP也是繪制代謝途徑的有效工具,可用于翻譯后修飾、蛋白質﹣蛋白質相互作用的研究及蛋白質基本功能的闡述,進而繪制出更全面的蛋白質相互作用網絡,例如在翻譯后修飾方面的研究,蛋白質的磷酸化會影響蛋白質的熱穩定性,其修飾前后的熱穩定性差異可以用TPP測量。

            由于CETSA及TPP技術為了保持蛋白的活性,依賴于使用不含洗滌劑的緩沖液提取細胞蛋白,而無法獲得足夠的膜蛋白,因此,在CETSA和TPP實驗中引入非變性洗滌劑(NP-40),擴大了對膜蛋白覆蓋率,通過改良后的方法成功識別出毒毛旋花苷G的膜蛋白靶點鈉鉀離子泵。此外,CETSA及TPP技術在低豐度蛋白質的檢測方面存在限制,研究者通過將亞摩爾濃度的親和純化蛋白復合物樣本作為TMT復用器中的等壓觸發通道引入到突變TPP(mTPP)技術中來促進熱蛋白質組分析實驗中低豐度蛋白質的檢測,可用來獲得基于TPP或mTPP技術遺漏的蛋白質的熱分析數據。許多生物學相關、疾病相關的蛋白質在細胞中的豐度相對較低,該方法在蛋白疾病標志物及低豐度的靶點蛋白發現方面具有很大潛力。

            CETSA及TPP技術中,為保證數據的可信度,通常需要至少10個溫度點的樣品,若增加重復次數或不同處理條件,樣品數量將達到幾十甚至幾百個,雖然TPP通過多重定量質譜法實現了高通量分析,這龐大的分析通量依然是一個巨大的挑戰?;诖?,研究者們提出了“合并為一鍋”策略,命名為蛋白質組整體溶解度改變校術(PISA),并將其與TPP聯用,稱為PISA-T。此策略通過將多個加熱溫度點的樣品等量混合成為單個合并樣品再進行分析,并將CETSA測定熱融曲線的“位移變化”轉變為“積分變化”,這種策略不僅減少了分析樣品數量,增加了篩選靶蛋白的特異性,同時也減少了分實驗誤差,但樣品的合并減小了單個樣品的差異值,一定程度上導致原有篩選炅鐵度的降低。

            CETSA及TPP技術通過分析蛋白質組樣品在高溫處理下的可溶性上清蛋白進行藥物靶蛋白篩選,而變性沉淀的部分一真未受到重視。配體穩定靶點識別技術(TILS)將研究對象轉變為加熱之后產生的不可溶沉淀部分,成為CETSA及TPP技術的補充方法,但低效的樣品處理程序阻礙了沉淀的分析,近來研究報道了一種微球輔助的熱致沉淀分析方法(MAPS),通過在加熱之前向體系中引入足量的微球材料,未結合小分子配體的蛋白質結構展開后將聚集在微粒表面,而結合小分子配體的蛋白質結構展開需要相對較高溫度,通過分析聚集在微粒表面蛋白的差異來識別小分子藥物的靶點。在樣品前處理步驟中,MAPS技術采用快速、高通量的SP3(SP3)法并在微粒的表面運行。根據該方法,將沉淀在微粒上的蛋白質進行洗滌、還原、烷基化、消化及除鹽處理,整個樣品制備過程均在微粒表面進行,不涉及任何樣品轉移,樣品損失較少,更加適用于微量樣品。在數據處理方面,開發了靈敏度更高的處理方法,不再依賴于繪制熱熔曲線,而是以通過比較有無小分子配體存在的整體穩定性差異,并整合多個溫度點的數據,進而放大了熱穩定性變化的差異,相較于TPP技術,MAPS具有更高的特異性。此外,近來有學者將TPP熱處理得到的上清和沉淀中含有配體誘導的蛋白穩定性轉移的互補信息進行有機整合,開發了一種沉淀支持的TPP(PSTPP)分析方法,用于在蛋白質組水平上對蛋白質﹣藥物相互作用進行無偏和全面的分析。在PSTPP技術中,只使用蛋白質沉淀顯著的溫度來誘導蛋白質變性,并利用上清組分和沉淀組分中包含的互補信息來提高篩查的特異性和靈敏度。除此之外,還提出了一種新的基于深度學習的圖像識別算法來識別目標蛋白,克服了熱熔曲線擬合策略存在的問題。

            由于CETSA及TPP技術均需多個溫度點,研究者開發了等溫位移分析(iTSA),此方法可在單一溫度點下進行熱穩定性測定,通過增加樣品的重復次數、可使靶蛋白鑒定的統計學可信度達到與CETSA/TPP相似的效果,iTSA具有更高的通量選擇、更簡單的實驗設計及工作流程,相較于CETSA/TPP,iTSA是一種更高效的方法,但由于該方法中增加的樣品重復次數,此方法并不能大幅度減少所需分析的樣品數,且可能會因溫度過于單一導致錯誤識別,例如識別出脫靶后結合的蛋白。

            CETSA類靶點發現技術是目前應用最為廣泛的非標記靶點發現技術,且在近年來得到快速的發展。

            基于克隆擴增的鑒定方法

            1、三雜交系統

            目前主要有兩種三雜交系統:酵母三雜交系統和哺乳動物三雜交系統,前者是在酵母中進行,后者是在哺乳動物中進行。在三雜交系統中,DNA結合域與轉錄激活域的相互作用是通過小分子化合物的橋聯完成的,互補DNA編碼的靶蛋白可直接通過這種方法進行分離鑒定。但未正確折疊和轉錄后修飾的靶蛋白、膜結合蛋白和部分蛋白質復合物無法鑒定,并且雜交的配體必須能夠進入母細胞并保持活性。

            2、顯示技術

            顯示技術包括噬菌體顯示法和mRNA顯示法等。噬菌體由于對其配體的特異親和性而不斷得到富集,因此噬菌體顯示法可檢測微弱表達的蛋白,并能確定其亞結構域與結合的關系。但有些蛋白質功能的實現需要折疊、轉運等,導致無法在噬菌體中獲得表達,限制了噬菌體顯示法的應用。

            mRNA顯示法是將mRNA與其編碼的多肽用嘌呤霉素連接融合,該融合物被純化,經過逆轉錄得到cDNA以進一步擴增、表達,之后與固定于固相載體上的小分子共同孵育以鑒定。但在表達、克隆及顯示的過程中產生的多肽大多具有毒性,因此mRNA顯示法同樣存在局限性。

            其他藥物作用靶點發現和鑒定方法

            1、比較分析研究的鑒定方法

            隨著用小分子處理細胞得到的可用數據逐漸增多,化合物的特有“指紋”如基因表達、蛋白組譜、表型的多參數分析、細胞毒性數據的收集成為可能,由此形成的數據庫可通過相似性比較,識別當前小分子的靶標,其是目前最有效的識別藥物的方法之一。

            2、副作用報告系統的鑒定方法

            化學小分子靶標的鑒定不僅可用于闡明相關化合物的作用方式,也可用來識別所謂的“脫靶”蛋白,即化學小分子作用的靶標以外的蛋白。藥物小分子與“脫靶”蛋白結合,產生不良反應甚至生物毒性。Takarabe等的利用副作用報告系統定義了所有藥品的藥理學相似性,同時運用靶蛋白基因組序列的相似性發明了一種可以在大范圍預測未知藥物﹣靶標反應的方法,特別是針對那些無法預知藥物化學結構的未知反應,并對1874種有已知靶標的藥物的“脫靶”蛋白以及2519種靶標未知的藥物的可能靶標進行了綜合性預測。

            3、溶劑誘導蛋白沉淀技術

            丙酮、乙醇、甲醇和乙腈等落劑通常用于沉淀蛋白質,而小分子配體﹣蛋白質復合物具有較低的能量狀態,因此小分子配體﹣蛋白質復合物中的蛋白相較于游離蛋白質更能抵抗溶劑誘導的變性沉淀?;谶@一原理,結合穩定同位素二甲基標記的蛋白質組學,提出了SIP技術。利用SIP技術成功地檢測細胞裂解物中甲氨蝶呤、SNS-032和星形孢菌素的已知蛋白質靶標,驗證了SIP方法的可行性,并利用SIP方法,成功鑒定了HSP90家族的三種已知蛋白和幾種潛在的脫靶蛋白。

            4、機械應力誘導蛋白沉淀技術

            與熱應力類似,機械應力也可以誘導蛋白質沉淀。在機械應力作用下,蛋白質會隨著蛋白質構象的變化而逐漸沉淀,從而在微粒表面聚集,小分子配體﹣蛋白質復合物中的蛋白相較于游離蛋白質更能抵抗機械應力誘導的變性沉淀,通過對比微粒表面聚集的蛋白的差異,開發了一種用于藥物靶點發現的MSIPP方法?;贛SIPP技術成功地發現了細胞裂解物甲氨蝶呤、雷替曲塞的已知蛋白質靶標,驗證了SIPP方法的可行性,這也是首次通過非標記的藥物發現技術證朋二氫葉酸還原酶是雷替曲塞的直接作用粑點。

            5、基于離子的蛋白質組綜合溶解度改變技術

            現有的基于溫度的蛋白質沉淀靶點發現方法存在許多限制因素,比如,有些蛋白并不會隨著溫度的升高發生去折疊產生沉淀,熱熔曲線并不總是理想的S形,使得Tm的測定復雜化,近兩年新提出的一些等溫蛋白沉淀法SIP、MSIPP僅適用于裂解液實驗?;诖司窒扌?,有研究者提出了I-PISA技術。某些陰離子、陽離子可以改變蛋白質溶解度,進而導致蛋白質沉淀,稱之為基于離子的蛋白質沉淀方法。I-PISA技術將基于離子的蛋白質沉淀方法與PISA分析相結合,利用了蛋白結合藥物后結構更加穩定,能夠在一定程度上抵抗離子誘導沉淀的特性,通過對比藥物孵育和溶劑孵育的裂解液得到的上清液中各蛋白的豐度,將藥物孵育組顯著增高的蛋白認定為潛在靶蛋白。I-PISA法對于細胞裂解液和完整細胞均適用,且可以檢測微量蛋白的溶解度變化。

            6、靶點響應性可及性變化譜技術

            靶蛋白與小分子配體結合后,小分子配體結合域與靶點蛋白的活性口袋緊密結合,其誘導變構區域的氨基酸殘基的可及性發生顯著變化,該變化能夠被還原烷基化等化學共價標記反應所捕捉,再利用質譜定量蛋白質組學手段對細胞內的全蛋白組進行分析,能夠獲得真實生物體系內小分子孵育后全體蛋白組的可及性變化信息,從中篩選出小分子誘導可及性變化最顯著的蛋白即為小分子靶蛋白,該技術被稱為TRAP技術。TRAP技術能夠普適性的運用于多個小分子配體的高通量靶標發現,能夠提供部分的配體結合位點的信息,并適用于與小分子存在弱結合的靶標發現。

            五、展望

            化學小分子藥物作用靶點的發現和鑒定方法在藥物研發和化學小分子藥物作用機制的研究中發揮極其重要作用。相對于根據可能的靶點對下游物質產生效應進行推測的方法,直接鑒定更加準確。新近的研究技術,包括高通量的掃描、高靈敏度的質譜分析、化學探針、正電子發射斷層成像技術、體內生物熒光成像技術等的發展促進了靶蛋白的分離和鑒定。

            目前一種藥物作用于多種蛋白的概念已被逐漸接受,藥物的研發和合成并不只是針對致病基因和蛋白,而是研究整個藥物作用和致病作用的網絡。這對化學小分子藥物作用靶點的發現和鑒定提出了更高的要求。隨著基因組學、蛋白質組學、生物信息學、遺傳學及生物技術等學科的持續發展,現有方法還會不斷完善,新方法、新策略將不斷涌現,屆時可發掘出更多藥物新靶點,明確相關靶點的藥物作用機制,進而更好地研制高效安全的藥物。

             


            文獻資料

            1、陳杰波等,化學小分子靶標鑒定方法的研究進展,醫學綜述,2020,26(7)1293~1297

            2、馬婕等,無化學修飾的小分子藥物靶蛋白鑒定技術及其應用進展,生物工程學報,2021,37(4)1131~1138

            3、林園園等,非標記小分子藥物靶點發現技術及其在中藥研究中的應用,藥學學報,2023,58(5)1117~1127

             

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